扫描电镜样品制备：细胞固定与SEM成像的最佳实践226

扫描电子显微镜 (SEM) 是一种强大的成像技术，能够以极高的分辨率呈现样品的表面细节。在生物学研究中，SEM 常用于观察细胞的形态结构。然而，由于细胞本身是水性的且脆弱的，直接进行 SEM 成像是不可能的。因此，对细胞进行恰当的固定处理是获得高质量 SEM 图像的关键步骤。本文将深入探讨细胞固定在 SEM 样品制备中的重要性，以及各种细胞固定方法的优缺点，并为研究人员提供最佳实践建议，以确保获得最佳的成像结果。

关键词：细胞固定, 扫描电镜 (SEM), 样品制备, 固定剂, 脱水, 临界点干燥, 生物样品, 细胞形态, SEM成像, 图像质量, 最佳实践, 戊二醛, 锇酸, 酒精脱水, 二氧化碳临界点干燥, 离子溅射镀膜

一、细胞固定：保持细胞结构完整性的关键

细胞固定是指利用化学试剂将细胞中的蛋白质和其它生物大分子交联，从而使其结构稳定，防止细胞自溶和变形。有效的细胞固定是获得具有代表性的细胞形态和超微结构的先决条件。不恰当的固定会引起细胞收缩、膨胀、伪影等问题，严重影响 SEM 图像的质量和数据的可靠性。 选择合适的固定剂和固定方法取决于细胞类型、研究目标以及后续的成像步骤。

二、常用的细胞固定剂

常用的细胞固定剂包括醛类固定剂（如戊二醛和甲醛）和锇酸。戊二醛是一种常用的交联剂，它能够有效地固定细胞蛋白，保持细胞的三维结构。戊二醛的优点是渗透性好，能够有效地固定细胞内部结构。然而，戊二醛的固定效果容易受到pH值和温度的影响。甲醛的渗透性比戊二醛更好，但其交联作用较弱。 锇酸是一种强氧化剂，能够有效地固定细胞膜和细胞器，并提高样品的对比度。然而，锇酸具有毒性，使用时需要格外小心。 许多研究者会将戊二醛和锇酸联合使用，以达到最佳的固定效果。戊二醛进行初步固定，保持细胞形态；锇酸进行后固定，增强细胞膜和细胞器的对比度。

三、细胞固定方法及步骤

细胞固定过程通常包括以下几个步骤：
样品采集：快速采集细胞样品，尽量减少细胞损伤。
初步固定：将样品浸入戊二醛固定液中，通常在4℃下进行，固定时间根据细胞类型和大小而定，一般为1-4小时。固定时间过短，细胞固定不充分；时间过长，可能会导致细胞结构过度交联，影响成像。
后固定 (可选)：用锇酸进行后固定，增强细胞膜对比度，通常在4℃下进行1-2小时。
清洗：用缓冲液反复清洗样品，去除残留的固定剂。
脱水：利用梯度浓度的酒精或丙酮脱去细胞中的水分，防止在干燥过程中产生气泡和细胞结构破坏。脱水步骤通常包括一系列不同浓度的脱水剂，例如30%、50%、70%、90%、100% 的酒精溶液，每个浓度停留一定时间。
临界点干燥：用临界点干燥仪去除样品中的酒精或丙酮，避免表面张力造成的细胞结构损伤。临界点干燥是SEM样品制备的关键步骤，它能够在不破坏细胞结构的情况下去除样品中的液体。常用的临界点干燥介质是液态二氧化碳。
喷金或喷铂：为了增强样品的导电性，提高图像质量，需要对样品进行喷金或喷铂等镀膜处理。这层薄膜可以减少样品在电子束照射下的充电效应，获得清晰的图像。
SEM成像：最后，将样品置于扫描电子显微镜下进行成像。

四、影响细胞固定效果的因素

除了固定剂的选择，以下因素也会影响细胞固定效果：
固定时间：过短或过长的固定时间都会影响固定效果。
固定剂浓度：浓度过高或过低都会影响固定效果。
温度：低温更有利于保持细胞结构。
渗透压：固定剂的渗透压应与细胞内渗透压相近，避免细胞收缩或膨胀。
pH值：固定剂的pH值应控制在合适的范围内。

五、不同细胞类型的固定方法差异

不同类型的细胞对固定剂和固定方法的反应可能不同。例如，一些细胞对戊二醛的敏感性较高，需要选择更温和的固定方法。对于一些脆弱的细胞，可能需要采用低温固定或其他特殊方法来保护细胞结构。

六、优化SEM成像的策略

除了细胞固定，其他样品制备步骤，例如脱水和临界点干燥，也会影响最终的SEM图像质量。选择合适的脱水剂和干燥方法，以及控制好干燥过程中的温度和压力，对于获得高质量的SEM图像至关重要。此外，喷镀的厚度和均匀性也影响图像质量。过薄的镀膜容易出现充电现象，而过厚的镀膜则会掩盖样品细节。

七、结论

细胞固定是SEM样品制备中至关重要的步骤，它直接影响最终图像的质量和数据的可靠性。选择合适的固定剂和方法，并优化整个样品制备流程，对于获得高质量的SEM图像至关重要。研究者需要根据具体的细胞类型和研究目标，选择最合适的细胞固定方案，并不断优化实验步骤，以获得最佳的实验结果。 持续的学习和实验改进是获得高质量SEM图像的关键。

2025-03-19

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